Комплексное исследование состава экстрактов жира рыб и количественные критерии для различения стандартизированных экстрактов омега-3 ПНЖК

Громова О.А.1, Торшин И.Ю.1, Зайчик Б.Л.2, Тетруашвили Н.К.3,Рудаков К.В.1

1 Института Фармакоинформатики, ФИЦ «Информатика и Управление» РАН, Россия, Москва
2 Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН, Россия, Москва
3 ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова МЗ РФ, Россия, Москва

Комплексное исследование состава экстрактов жира рыб и количественные критерии для различения стандартизированных экстрактов омега-3 ПНЖК

Абстракт

Эффективность препаратов полиненасыщенных жирных кислот (ω3 ПНЖК) в существенной мере зависит от стандартизации содержания экстрактов по эйкозапентаеновой кислоте (ЭПК), докозагексаеновой кислоте (ДГК) и другим видам жирных кислот. В настоящей работе мы провели комплексное исследование состава 11 препаратов ω3 ПНЖК с хроматографическим определением более 40 метаболитов жирных кислот и других соединений. Полученные данные по составу экстрактов анализировались с использованием современных методов интеллектуального анализа данных (метод метрических сгущений, многомерное шкалирование, метод принципиальных компонент с расшифровкой осей, тополого-метрический подход к распознаванию). В результате, получены количественные маркёры, позволяющие отделять препараты на основе стандартизированных ω3 ПНЖК (Омакор, Солгар омега-3 700, Солгар омега-3 950, Фемибион наталкер-2, Омега-3 концентрат и Омегамама) от менее стандартизированных (Fish oil-Teva, Омегатрин, Омеганол) на основе хроматографического анализа жирнокислотного состава препаратов: маркёр «ЭПК+ДГК», маркёр «ω6+ω11» и коэффициент стандартизации, оценивающий соответствие измеренных уровней омега-3 ПНЖК содержанию, заявляемому производителем.

Ключевые слова: стандартизация омега-3 ПНЖК, нутрициальная поддержка беременности, метрический анализ данных

Введение

Фундаментальные основы фармакологического действия омега-3 ПНЖК хорошо изучены и описаны в многочисленных оригинальных исследованиях и обзорных статьях [1, 2]. Вкратце, из таких омега-3 ПНЖК, как эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) и докозагексаеновая кислота (ДГК) образуются важнейшие медиаторы воспаления — эйкозаноиды и докозаноиды, в т.ч. нейропротектины, резолвины и маресины. Эйкозаноиды и докозаноиды, синтезируемые из ЭПК и ДГК в каскаде арахидоновой кислоты, имеют ключевое значение для осуществления физиологического окончания воспаления — т.н. «разрешения воспаления» (англ., resolution of inflammation). Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ω3 ПНЖК) принципиально необходимы для синтеза эндогенных медиаторов физиологического окончания воспаления (т.н. «разрешения воспаления»). Поэтому, препараты на основе ω3 ПНЖК, приготовляемые из экстрактов жира рыб, эффективны для терапии и профилактики широкого круга патологий, в т.ч. для профилактики и терапии ИБС [3], неврологии а также для нутрициальной поддержки беременности [4, 5].

Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) — важный фактор соматического и репродуктивного здоровья женщины. Потребность в омега-3 ПНЖК повышена при беременности и лактации, а также в группах риска (заболевания, ассоциированные с хроническими воспалительными процессами). Результаты обследования группы россиянок репродуктивного возраста (20-45 лет, n=895, в т. ч. 107 беременных) с использованием опросников диеты показали, что среднее суточное потребление составило 0.021±0.102 г/сут для ЭПК и 0.052±0.140 г/сут для ДГК при суточной потребности в ЭПК+ДГК более 0.5 г/сут. Более низкая обеспеченность женщин ЭПК и ДГК была ассоциирована со снижением адаптационного резерва сердечнососудистой системы (Р=0.04), хроническим бронхитом (Р=0.04), депрессией (Р=0.035), отсутствием верхних «зубов мудрости» (Р=0.014), предрасположенностью к аутоиммунным процессам (Р=0.031), а также с избыточным накоплением ушной серы (Р=0.0037) [1].

Принимая во внимание крайне низкую обеспеченность россиян омега-3 ПНЖК, необходимо использование препаратов омега-3 для компенсации нутрициального дефицита. Эффективность препаратов ω3 ПНЖК в существенной мере зависит от стандартизации содержания экстрактов по ЭПК, ДГК и другим видам жирных кислот. К сожалению, среди врачей всё ещё встречается терминологическая путаница, при которой все препараты омега-3 ПНЖК называются с использованием такого термина 300…500-летней давности, как «рыбий жир». Данный термин весьма условен и не соответствует реалиям современной фармакологии ω3 ПНЖК.

Во-первых, препараты, содержащие ω3 ПНЖК, могут изготовляться вообще без использования экстрактов жира рыб (с использованием, например, экстрактов жира морских млекопитающих, экстрактов водорослей, синтетических форм ω3 ПНЖК и др) [2].

Во-вторых, само использование термина «жир» не совсем грамотно биохимически, т.к. жирами называются сложные эфиры жирных кислот с глицерином. При реальном приготовлении препаратов омега-3 ПНЖК из экстрактов жира рыб, зачастую, проводится частичное омыление жиров исходного экстракта с удалением глицерина и с последующей этерификацией полученной смеси жирных кислот метиловым, этиловым и другими короткоцепочеными одноатомными спиртами. Полученная таким образом смесь никоим образом не является «жиром» в научном значении этого слова.

В-третьих, и самое главное, препараты ω3 ПНЖК, из какой бы природной субстанции они не приготовлялись, могут проходить существенную стандартизацию по составу. Например, эфиры жирных кислот в составе препарата Омакор содержат более 90% ω3 ПНЖК (по результатам настоящего исследования, более 97%). Конечно же, настолько стандартизированный по жирнокислотному составу экстракт, содержащий не более 14 индивидуальных веществ, является фармацевтическим препаратом с высокой степень очистки, а никаким не «рыбьим жиром».

Всё вышесказанное обуславливает необходимость проведения исследований химического состава различных экстрактов омега-3 ПНЖК на основе жира рыб [6, 7] и др.) с целью установления количественного и качественного состава препаратов омега-3 ПНЖК, реально используемых во врачебной практике. Например, в работе [8] было проведено качественное исследование состава некоторых из препаратов омега-3 ПНЖК, представленных на российском рынке. По данным тонкослойной хроматографии, основная часть исследованных препаратов относилась к двум группам: основным компонентом препаратов 1,9, 11 и 13 на Рис. 1 являются эфиры ЖК, а препаратов 2–4, 12,14 (рыбьего жира), 15 и 16 – триглицериды (Рис. 1).

Материалы и методы

Препараты, исследованные в настоящей работе, перечислены в Таблице 1. Отметим, что все исследованные препараты изготовлялись на основе жира тех или иных сортов рыбы в качестве исходного сырья.

Таблица 1. Краткая информация об исследованных препаратах омега-3 ПНЖК. НЗ, неизвестно.

ПрепаратКапсула, мгОмега-3, мгЭПК, мгДГК, мг
Омега-3 Доппельгерц Актив118630014496
Fish oil-Teva500165НЗНЗ
Омегатрин780397.8НЗНЗ
Омега-3 концентрат1000600330220
9 месяцев ОмегаМама70015023105
Фемибион наталкер-25002000200
Омеганол50032НЗНЗ
Омакор1000900460380
ДГК капс1200</td align=»center»>50060400
Солгар омега-3 7001730700360240
Солгар омега-3 9501950950504378

Хроматографическое определение жирнокислотного состава

Образцы растворяли в гексане и подвергали солянокислому гидролизу в присутствии метанола (Methanolic-HCl (3N) Supelco) в плотно укупоренных виалах при 90ОС в течение 1 часа. Полученные таким образом метиловые эфиры жирных кислот анализировали на хроматографе Shimadsu GCMS-QP2010 Ultra при следующих условиях:

Газ – носитель – гелий, линейная скорость 35,6 см/сек (0,9 мл/мин), деление потока 4:1. Колонка капиллярная MDN-5 (Supelco), длина 30 метров, внутренний диметр 0,25 мм. Параметры хроматографа: в режиме градиента температур, детектор 200ОС, интерфейс 205 ОС, режим измерения – от 45 до 450 m/z. Качественный состав полученных смесей определялся с использование библиотеки масс спектров NIST11.

В результате проведения настоящей серии экспериментов, каждый препарат описывался вектором из 44 позиций, в каждой из которых представлена площадь пика, соответствующая тому или иному соединению. Соединения, установленные в ходе настоящего исследования, перечислены в таблице 2.

Таблица 2. Соединения, найденные в исследованных образцах в результате проведения хроматографического анализа. MW, молекулярная масса, г/моль, «нас.», насыщенная жирная кислота

Соединение (англ.)СоединениеПНЖКMW
11-Eicosenoic acid, methyl ester11-эйкозеновая к-та, метиловый эфирω9325
11-Eicosenoic acid, propyl ester11-эйкозеновая к-та, пропиловый эфирω9353
13-Docosenoic acid, methyl ester13-докозеновая к-та, метиловый эфирω9353
13-Docosenoic acid, propyl ester13-докозеновая к-та, пропиловый эфирω9381
13-methyl Tetradecanoic acid, methyl ester13-метилтетрадеканоевая к-та, метиловый эфирнас.256
4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid, butyl ester4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфирДГК384
4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid, methyl ester4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, метиловый эфирДГК342
5,11,14,17-Eicosatetraenoic acid, methyl ester5,11,14,17-эйкозатетраеновая к-та, метиловый эфирЭТК318
5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid, ethyl ester5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, этиловый эфирЭПК330
5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid, methyl ester5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, метиловый эфирЭПК316
5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid, propyl ester5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, пропиловый эфирЭПК344
6,9,12,15-Hexadecatetraenoic acid, methyl ester6,9,12,15-гексадекатетраеновая к-та, метиловый эфирω3262
6,9,12,15-Octadecatetraenoic acid, butyl ester6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, бутиловый эфирω3332
6,9,12,15-Octadecatetraenoic acid, ethyl ester6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, этиловый эфирω3304
6,9,12,15-Octadecatetraenoic acid, methyl ester6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, метиловый эфирω3290
6,9,12-Hexadecatrienoic acid, methyl ester6,9,12-гексадекатриеновая к-та, метиловый эфирω3264
6-Octadecenoic acid, ethyl ester6-октадеценовая к-та, этиловый эфирω11310
6-Octadecenoic acid, methyl ester6-октадеценовая к-та, метиловый эфирω11296
7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid, butyl ester7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфирДГК384
7,10,13,16,19-Docosapentaenoic acid, methyl ester7,10,13,16,19-докозапентаеновая к-та метиловый эфирДПК342
7-methyl-6-Hexadecenoic acid, methyl ester7-метил-6-гексадеценовая к-таω9282
9,12-Octadecadienoic acid, ethyl esterЛинолевая к-та, этиловый эфирω6308
9,12-Octadecadienoic acid, methyl esterЛинолевая к-та, метиловый эфирω6294
9-Hexadecenoic acid, ethyl esterПальмитолеиновая к-та, этиловый эфирω7282
9-Hexadecenoic acid, methyl esterПальмитолеиновая к-та, метиловый эфирω7268
9-Octadecenoic acid, ethyl esterОлеиновая к-та, этиловый эфирω9310
9-Octadecenoic acid, methyl esterОлеиновая к-та, метиловый эфирω9296
Decanoic acid, methyl esterДеканоевая к-та, метиловый эфирнас.186
Dodecanoic acid, methyl esterДодеканоевая к-та, метиловый эфирнас.214
Eicosanoic acid, methyl esterЭйкозановая к-та, метиловый эфирнас.327
Eicosanoic acid, propyl esterЭйкозановая к-та, пропиловый эфирнас.355
Heptadecanoic acid, methyl esterМаргариновая к-та, метиловый эфирнас.284
Hexadecanoic acid, ethyl esterМаргариновая к-та, этиловый эфирнас.298
Hexadecanoic acid, methyl esterПальмитиновая к-та, метиловый эфирнас.270
Methyl nicotinateМетилникотинат137
Octadecanoic acid, ethyl esterСтеариновая к-та, этиловый эфирнас.312
Octadecanoic acid, methyl esterСтеариновая к-та, метиловый эфирнас.298
Octanoic acid, methyl esterКаприловая к-та, метиловый эфирнас.158
PantolactoneПантолактон130
Pentadecanoic acid, methyl esterПентадеканоевая к-та, метиловый эфирнас.256
Tetradecanoic acid, ethyl esterМиристиновая к-та, этиловый эфирнас.257
Tetradecanoic acid, methyl esterМиристиновая к-та, метиловый эфирнас.243
Tetradecanoic acid, methyl esterМиристиновая к-та, метиловый эфирнас.243
Tridecanoic acid, 12-methyl-, methyl ester12-метил-тридеканоевая к-та, метиловый эфирнас.242
Tridecanoic acid, 12-methyl-, methyl ester12-метил-тридеканоевая к-та, метиловый эфирнас.242
Tridecanoic acid, methyl esterТридеканоевая к-та, метиловый эфирнас.228

Для стандартной обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия Хи-квадрат, T-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни и тест Стьюдента в электронных таблицах Microsoft Excel.

Помимо стандартных методов статистики, в ходе анализа данных скрининга были использованы новые математические подходы к интеллектуальному анализу данных, основанные на методе метрических сгущений. Использован подход, основанный на фундаментальной концепции метрики (в математике, метрика — функция измерения расстояния между точками, которая удовлетворяет аксиоме треугольника). «Точками», в данном случае являются изученные параметры пациентов. Набор точек с заданной метрикой называется метрической конфигурацией. Измеряя попарные расстояния между этими точками, становится возможным установление метрических сгущений (кластеров близко лежащих точек) и, затем, построение метрических карт (проекций метрических конфигураций на плоскость), которые являются наглядными диаграммами, отражающими весь массив исследованных корреляций изучаемых параметров. Ниже приведены краткое описание алгоритма поиска метрических сгущений на основе ρ сетей, выбор вершин ρ-сети, построение метрической конфигурации как матрицы попарных расстояний и процедур поиска собственно метрических сгущений.

Пусть X – таблица описаний исследуемых объектов, в настоящем случае – препаратов омега-3 ПНЖК. Каждый из препаратов описывается набором числовых признаков (44 компонента жирнокислотного состава, перечисленные в Таблице 2). Будем считать, что каждому из препаратов соответствует 44-мерный вектор в пространстве соответствующей размерности, так что таблица X = {x1,…,xN} соответствует множеству из N точек. Задана метрика ρij = ρ(xi,xj), определенная на всех парах точек из . Метрическим сгущением называется множество близких, в смысле заданной метрики, точек, образующих компактные области.

Полученные в работах [9-13] результаты позволили разработать семейство новейших алгоритмов поиска сгущений (или т.н. «алгоритмов кластеризации»), которые основаны на «восстановлении» множества по компонентам его проекции на оси метрической конфигурации. Параметрами произвольного алгоритма из этой группы являются способ вычисления значений метрики ρij и распределение σ. Алгоритмы могут отличаться друг от друга используемым определением обобщённой плотности η, способом построения непрерывных представлений i-спектров {γiσ(r)} (осуществляемым, причём, с точностью до σ), способом выбора окрестности точки при анализе сгущений, способом выбора границ «сгущений» (или, наоборот, «разрежений»), критериями оценки качества набора сгущений и др.

В целом, алгоритм данного семейства строится следующим образом. На первом шаге алгоритма, при заданном распределении σ-изоморфизма, для каждой i-ой точки ρ-конфигурации вычисляются i-спектры {Fi(r) = γi(r)}, их непрерывные представления {Fi(r) = γiσ(r)} и профили обобщённой плотности {ηi(r) = Fi(r) = fi(r)}. i-спектром называется функция γi(r), которой соответствует подстановка γi = ((ρij1, | Οi(α,ρij1) ≤ ρij2 ≤ … ≤ ρijN, где Οi(α,xij1) = {j∈α | ρij ≤ r} — замкнутая сферическая x-окрестность i-ой точки в α.

На втором шаге, для каждой точки находится соответствующее множество Sj — множество множеств Sik, в которые входит j-ая точка α, Sj = {Sik | j∈Sik}. Множества Sik определяются как Sik = {sikm=j|ρij∈πik,m=l..nik,j=1..N}, где nik = |Sik|, а множества {πik} представляют собой множества интервалов, локализующих пики обобщённой плотности ηi(r) на i-ой оси. Множества ρi = {πik} = {[lb(rk,ki, min) … rb(rk,ki, min)]|rk∈ki, min}, k = 1 … |ki, max| вычисляются с использованием функции выделения элемента множества k, ближайшкго к r слева, lb(r,k) = a ∈ k, a < r | ∀b∈k,b<r:r-b&rt;r-a, функции выделения элемента множества k, ближайшего к r справа, rb(r,k)=a∈k,a&rt;r|∀b∈k,b<r:b-r&rt;a-r. Множества ki,min и ki,max вычисляются на основании определенных на первом этапе профилей обобщённой плотности {ηi(r) = Fi(r) = fi(r)}, ki,min = {r ∈ R | (η’i(r) = 0)∧(η»i(r)&rt;0)}, а множество координат всех максимумов обобщённой плотности – как ki,max = {r ∈ R | (η’i(r) = o)∧(η»i(r)&rt;0)}.

На третьем шаге, на основании множества {Sj} находится множество Xα = {χj=|Sj| /N}, каждый элемент которого является оценкой того, насколько часто j-ая точка входит в пики плотности (и, потенциально, входит в сгущение). Строится упорядоченное множество , в котором точки расположены по убыванию значений оценок . Одновременно, для каждой точки в списке определяется система β-окрестностей и находится соответствующее зерно, . Альтернативно, возможно вычислить значения , где оценивает выполнимость условия вхождения j-ой точки в максимум обобщённой плотности i-ой оси, и провести упорядочение точек и зёрен по списку . Далее, на основании упорядоченного списка зёрен и окрестностей строится дерево возможных (ξ,γ)-разбиений [14] точек и, на основании тех или иных критериев оценки качества набора сгущений, проводится анализ дерева возможных (ξ,γ)-разбиений. Пример реализации такого алгоритма нахождения сгущений посредством итеративной процедуры более подробно описан в работах [15].

Многомерное шкалирование, необходимое для визуализации получаемых результатов и метод принципиальных компонент с расшифровкой осей основаны на построении метрических карт. Карта метрической конфигурации или просто «метрическая карта» является наглядной диаграммой, отражающей весь массив исследованных корреляций. С математической точки зрения, метрическая карта представляет собой проекцию метрической конфигураций на плоскость. Эта проекция осуществляется на основе определенной ранее матрицы расстояний точек-сети то остальных точек . Посредством гомоморфного преобразования, метрическая конфигурация (X, ρ), описанная матрицей , проецируется в декартово пространство Rn размерности n. Подпространство , построенное на двух главных вершинах -сети, содержит искомую проекцию исследуемой метрической конфигурации на плоскость.

Результаты

В результате проведения экспериментов были получены хроматограммы для каждого из 11 препаратов, перечисленных в Таблице 1 (см. Таблицу 3). Каждый из пиков на хроматограмме бы идентифицирован по библиотеке масс спектров NIST11; площадь пика отображает процентное содержание соответствующего соединения в исследованном образце.

Таблица 3. Хроматограммы исследованных соединений. Цифры над пиками обозначают соединения, которые соответствуют данному пику.

ПрепаратХроматограмма
Омега-3 Доппельгерц Актив

увеличить рисунок

Fish oil-Teva

увеличить рисунок

Омегатрин

увеличить рисунок

Омега-3 концентрат

увеличить рисунок

9 месяцев Омегамама

увеличить рисунок

Фемибион наталкер-2

увеличить рисунок

Омеганол

увеличить рисунок

Омакор

увеличить рисунок

ДГК капс

увеличить рисунок

Солгар омега-3 700

увеличить рисунок

Солгар омега-3 950

увеличить рисунок

Даже простой визуальный анализ полученных хроматограмм показывает, что есть некоторая группа препаратов с большим количеством пиков (Fish oil-Teva, Омегатрин, Омега-3 концентрат), которые соответствуют более низкому качеству стандартизации жирнокислотного состава и есть препараты с малым числом пиков (Омегамама, Омакор, Солгар и др.), что соответствует более высокому качеству стандартизации состава.

По качественному составу (наличие этиловых, пропиловых бутиловых эфиров жирных кислот, см. Таблицу 2) образцы можно условно разделить на два типа: (1) «естественные» жиры, которые, судя по жирнокислотному составу, аналогичны «рыбьему жиру» (например, хроматограмма образца № 2 Fish oil-Teva) и (2) «синтетические» жиры, содержащие в большом количестве не липиды, а эфиры жирных кислот – ведь этиловые, пропиловые и бутиловые эфиры жирных кислот имеют явно искусственное происхождение (например, хроматограмма образца №11 Солгар омега-3 950 или образца №8 Омакор, Рис. 2).

увеличить рисунок

Рис. 2. Расшифровка хроматограммы препарата омега-3 ПНЖК (на примере образца №11 Солгар омега-3 950). Пики: 1 — Миристиновая к-та, метиловый эфир, 2 — 6,9,12,15-гексадекатетраеновая к-та, метиловый эфир, 3 — Пальмитолеиновая к-та, метиловый эфир, 4 — Пальмитиновая к-та, метиловый эфир, 5 — Пальмитолеиновая к-та, этиловый эфир, 6 — Маргариновая к-та, этиловый эфир, 7 — Линолевая к-та, метиловый эфир, 8 — Олеиновая к-та, метиловый эфир, 9 — Стеариновая к-та, метиловый эфир, 10 — 6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, этиловый эфир, 11 — Линолевая к-та, этиловый эфир, 12 — Олеиновая к-та, этиловый эфир, 13 — Стеариновая к-та, этиловый эфир, 14 — 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, метиловый эфир, 15 — 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, этиловый эфир, 16 — 6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, бутиловый эфир, 17 — 11-эйкозеновая к-та, пропиловый эфир, 18 — Эйкозановая к-та, пропиловый эфир, 19 — 5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, пропиловый эфир, 20 — 4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, метиловый эфир, 21 — 4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфир, 22 — 7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфир, 23 — 13-докозеновая к-та, пропиловый эфир.

Для установления более четких количественных критериев различий в качестве экстрактов омега-3 ПНЖК мы применили методы интеллектуального анализа данных к собранным нами результатам хроматографического исследования состава препаратов. Каждый препарат был представлен концентрациями 44 веществ (Таблица 2).

Следует отметить, что концентрации каждого из молекулярных компонентов, перечисленных в Таблице 2, коррелируют друг с другом в исследованных препаратах омега-3 ПНЖК. Данные корреляции настолько выражены, что возможно прогнозировать концентрации любой из молекул в Таблице 2 посредством тополого-метрического подхода к распознаванию при условии, если известны концентрации определённых «компонентов-предикторов» (см. Таблицу 3). Аккуратность получаемых таким образом прогнозов была достаточно высока: коэффициент корреляции между прогнозируемыми и измеренными концентрациями составил, в среднем, r=0.77±0.22. Отметим, что среди предикторов перечислены концентрации различных форм ДГК, ЭПК, омега-6 линолевая кислота и омега-9 жирные кислоты. Некоторые из перечисленных предикторов оказались важны для получения информативных маркёров стандартизации экстрактов омега-3 ПНЖК (см. далее).

Таблица 3. Информативные предикторы, на основании концентраций которых можно прогнозировать концентрации всех остальных компонентов. Рейтинг предиктора соответствует проценту молекулярных компонентов экстрактов, для прогнозирования концентраций которых данный предиктор необходим.

РейтингПредиктор
100%Эйкозановая к-та, метиловый эфир нас.
99%4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфир ДГК
80%13-докозеновая к-та, метиловый эфир ω9
70%6,9,12,15-гексадекатетраеновая к-та, метиловый эфир ω3
70%5,11,14,17-эйкозатетраеновая к-та, метиловый эфир ЭТК
53%7,10,13,16,19-докозапентаеновая к-та метиловый эфир ДПК
50%Линолевая к-та, этиловый эфир ω6
50%11-эйкозеновая к-та, пропиловый эфир ω9
47%5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, метиловый эфир ЭПК
43%6,9,12-гексадекатриеновая к-та, метиловый эфир ω3
43%7-метил-6-гексадеценовая к-та ω9
40%11-эйкозеновая к-та, метиловый эфир ω9
23%4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, метиловый эфир ДГК

Возвращаясь к анализу жирнокислотного состава исследованных препаратов, в результате проведения хроматографического анализа каждый препарат был представлен вектором из 44 позиций, соответствующих веществам в Таблице 2. С использованием метрики Колмогорова-Смирнова в приложении к этим 44-мерным векторам, мы рассчитали «расстояния» между препаратами, исследовали наличие кластеров и представили полученные результаты на метрической карте (Рис. 3).

Рис. 3. Метрическая карта жирнокислотного состава исследованных препаратов. Оси X и Y отражают (в у.е.) некоторые «главные компоненты» состава, которые расшифровываются далее в тексте настоящей статьи. Метрическая карта представляет собой проекцию матрицы попарных расстояний между всеми препаратами на плоскость рисунка. Более близкие точки на карте соответствуют препаратам, более близким по жирнокислотному составу. Методом анализа метрических сгущений установлено наличие единственного кластера, соответствующего препаратам со слабой стандартизацией состава.

увеличить рисунок

В результате проведения анализа метрических сгущений мы выделили кластер препаратов, которые отличаются достаточно низкой стандартизацией состава (Рис.). Действительно, из 5 препаратов, вошедших в кластер, для 3 препаратов (а именно, Fish oil-Teva, Омегатрин, Омеганол) производителями не указывается даже приблизительное содержание ЭПК и ДГК. Отсутствие такой информации является косвенным свидетельством отсутствия надлежащей стандартизации состава при производстве препаратов (см. Таблицу 1). Стандартизация состава разными производителями омега-3 ПНЖК проводится по-разному, поэтому точки, соответствующие остальным препаратам, расположены в различных направления от кластера слабо стандартизированных препаратов.

Представляет интерес рассмотреть, наличие каких же конкретных компонентов жирнокислотного состава позволяет отличать препараты в кластере с низкой степенью стандартизации состава от препаратов с более высокой степенью стандартизации. Полученные при построении метрической картой «условные оси» X и Y должны соответствовать содержанию каких-то более конкретных веществ или групп веществ. Для установления конкретных показателей биохимического качества стандартизации мы сравнили содержание всех 44 веществ в кластере слабо стандартизированных препаратов с содержанием этих веществ во всех остальных препаратах. Установленные различия суммированы в Таблице 4.

Таблица 4. Различия жирнокислотного состава препаратов омега-3 ПНЖК (площади пиков хроматограмм, %) и маркёры, позволяющие отличать более стандартизированные препараты от менее стандартизированных (кластер). Маркёр «ЭПК+ДГК» — сумма площадей пиков 5,8,11,14,17-ЭПК (пропиловый эфир), 4,7,10,13,16,19-ДГК (бутиловый эфир), 4,7,10,13,16,19-ДГК (метиловый эфир). Маркёр «ω6+ω11» — сумма площадей пиков следующих компонентов: 6-октадеценовая к-та, метиловый эфир, 6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, метиловый эфир, линолевая к-та, метиловый эфир.

СоединениеЖКСтандарти-зированныеМенее стандарти-зированныеР
6-октадеценовая к-та, метиловый эфирω111.26±1.533.25±1.670.009
13-метилтетрадеканоевая к-та, метиловый эфирнас.0.02±0.040.11±0.100.013
Миристиновая к-та, метиловый эфирнас.0.62±1.183.03±2.780.016
Миристиновая к-та, метиловый эфирнас.0.62±1.183.03±2.780.016
Додеканоевая к-та, метиловый эфирнас.0.01±0.020.05±0.060.018
Пальмитолеиновая к-та, метиловый эфирω71.28±2.005.09±4.810.019
6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, метиловый эфирω30.93±0.892.18±1.880.029
Линолевая к-та, метиловый эфирω60.72±0.676.35±3.900.035
5,8,11,14,17-эйкозапентаеновая к-та, пропиловый эфирЭПК1.44±1.160.43±0.740.041
Пальмитиновая к-та, метиловый эфирнас.3.76±7.8010.6±7.740.042
6,9,12,15-гексадекатетраеновая к-та, метиловый эфирω30.08±0.090.68±1.120.047
6,9,12-гексадекатриеновая к-та, метиловый эфирω30.11±0.100.55±0.900.053
4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, бутиловый эфирДГК12.5±12.43.95±6.840.055
Олеиновая к-та, метиловый эфирω94.43±6.1218.8±15.60.057
4,7,10,13,16,19-докозагексаеновая к-та, метиловый эфирДГК19.3±14.68.97±2.670.059
Маркёры стандартизации
Маркёр «ЭПК+ДГК»33.3±10.313.3±4.920.0016
Маркёр «ω6+ω11»2.06±2.2010.2±1.890.0004

В результате проведенного анализа данных и расшифровки осей метрической карты было получено два наиболее информативных маркёра жирнокислотного состава, которые позволяют максимально эффективно отличать более стандартизированные препараты омега-3 ПНЖК от менее стандартизированных.

Маркёр «ЭПК+ДГК» представляет собой сумму площадей пиков 5,8,11,14,17-ЭПК (пропиловый эфир), 4,7,10,13,16,19-ДГК (бутиловый эфир), 4,7,10,13,16,19-ДГК (метиловый эфир). Значения маркёра «ЭПК+ДГК» были достоверно выше в группе более стандартизированных препаратов (33.3±10.3%), чем в группе менее стандартизированных (13.3±4.9%, Р=0.0016).

Маркёр «ω6+ω11» — сумма площадей пиков следующих компонентов: 6-октадеценовая к-та, метиловый эфир, 6,9,12,15-октадекатетраеновая к-та, метиловый эфир, линолевая к-та, метиловый эфир. Значения маркёра «ω6+ω11» были достоверно ниже в группе более стандартизированных препаратов (2.06±2.2±10.3%), чем в группе менее стандартизированных (10.2±1.9%, Р=0.0004).

Диаграмма состава исследованных препаратов в осях «ω6+ω11» — «ЭПК+ДГК» представлена на Рис. 4. Очевидно, что более стандартизированные препараты лежат в области диаграммы на Рис., соответствующей значениям маркёров «ЭПК+ДГК»>23%, «ω6+ω11»<5%. Менее стандартизированные препараты лежат в области диаграммы, соответствующей «ЭПК+ДГК»<20%, «ω6+ω11»>8%.

Рис. 4. Диаграмма состава исследованных препаратов в осях, соответствующих разработанным маркёрам жирнокислотного состава — «ω6+ω11» и «ЭПК+ДГК».

 

увеличить рисунок

Полученные нами маркёры позволяют проводить своего рода «скрининговое» исследование качества стандартизации субстанций для изготовления препаратов омега-3 ПНЖК. Предположим, что в результате хроматографического анализа получены следующие значения маркёров: «ЭПК+ДГК»=13%, «ω6+ω11»=9%. Очевидно, что такие значения соответствуют низкой стандартизации препарата по омега-3 ПНЖК и высокому уровню примесей, характерных для т.н. «рыбьего жира». Если же препарат стандартизирован, что значение маркёра «ЭПК+ДГК» никак не меньше 23%, а значение маркёра «ω6+ω11» не должно быть выше 5%.

В дополнение к маркёрам «ЭПК+ДГК» и «ω6+ω11», позволяющим классифицировать препараты омега-3 ПНЖК как более стандартизированные и менее стандартизированные, мы также вводим «коэффициент стандартизации» (КСТ), оценивающий соответствие реально измеренных уровней омега-3 ПНЖК содержанию омега-3 ПНЖК, заявляемому производителем. КСТ рассчитывается как композиция четырёх компонент:

КСТ(%)=1-ω3соотв-ЭПКсоотв-ДГКсоотв-Др.ω3соотв, где

ω3соотв= ω3заявл(%)-ω3изм(%) соответствие заявленного общего содержания омега-3 ПНЖК измеренному. Если препарат содержит больше ω3, чем заявлено, то это увеличивает ω3соотв ;

ЭПКсоотв=ЭПКзаявл(%)-ЭПКизм(%), если заявлено содержание ЭПК. Если нет, то назначается «штрафной процент» (мы использовали величину в 15%, которая отражает среднее содержание ЭПК в слабо стандартизированных препаратах)

ДГКсоотв=ДГКзаявл(%)-ДГКизм(%), если заявлено содержание ДГК, в противном случае — «штрафной процент» (10%).

Др.ω3соотв=|Др.ω3заявл — Др.ω3изм| — абсолютное значение разности между заявленным измеренным содержанием других омега-3 ПНЖК. Др.ω3 определяется как разница между общим содержанием омега-3 и суммарным содержанием ЭПК+ДГК.

Примеры расчёта коэффициента стандартизации КСТ(%) приведены в Таблице 5. Препараты Омакор, Солгар омега-3 950, Фемибион наталкер-2 и Омегамама характеризовались наиболее высокими значениями коэффициента стандартизации. Результаты оценка «качества» стандартизации посредством КСТ(%) соответствуют оценкам с использованием маркёров «ЭПК+ДГК», «ω6+ω11», т.к. установлены достоверные корреляции между коэффициентом стандартизации и значениями маркёров «ЭПК+ДГК», «ω6+ω11» (Рис. 5).

Тем не менее, коэффициент КСТ(%) предоставляет дополнительную информацию о качестве стандартизации. Например, значение КСТ(%) для «Омега-3 Доппельгерц Актив» было достаточно высоко (102.1%), т.к. реально измеренное содержание различных ПНЖК в соответствующем образце практически полностью соответствовало содержанию, заявляемому изготовителем (Таблица 5).

Таблица 5. Коэффициент стандартизации препаратов омега-3 ПНЖК. Препараты упорядочены по убыванию значения коэффициента КСТ(%), оценивающего соответствие измеренного жирнокислотного состава заявляемому составу. «Др. ω3» – разность между общим количеством ω3 и суммой ЭПК+ДГК.

ПрепаратЗаявлено, %Измерено, %КСТ(%)
ЭПКДГК Др. ω3ЭПКДГК Др. ω3
Омакор46.038.06.046.544.85.8114.2%
Солгар омега-3 95037.328.05.035.534.15.4113.5%
Фемибион наталкер-2040.00.013.446.016.0110.5%
Омегамама4.621.04.47.822.34.0108.2%
Омега-3 концентрат33.022.05.032.126.28.4106.6%
Солгар омега-3 70032.721.89.131.225.412.9104.1%
Омега-3 Доппельгерц Актив15.210.16.315.510.811.5102.1%
ДГК капс5.033.33.316.411.815.579.8%
Омеганол0.010.71.977.7%
Омегатрин24.721.75.770.4%
Fish oil-Teva16.210.313.068.5%

Рис. 5. Корреляции между коэффициентом стандартизации КСТ(%) и значениями маркёров качества стандартизации («ЭПК+ДГК», «ω6+ω11»).

Кроме того, при оценке препаратов омега-3 ПНЖК с точки зрения нутрициальной поддержки беременности, достаточно важно оценить относительное содержание ДГК в препарате по отношению ко всем остальным омега-3 ПНЖК. Дело в том, что во время беременности истощается депо ДГК в мембранах эритроцитов, т.к. последние усиленно переносят ДГК к плоду [16]. Поэтому, для нутрициальной поддержки беременных важно высокое соотношение ДГК:ЭПК (например, 5:1). Среди исследованных препаратов, отличающихся более высоким качеством стандартизации и коэффициента КСТ (%), наибольшее относительное содержание ДГК было найдено в препарате 9 месяцев ОмегаМама и, несколько меньшее, в препарате Фемибион наталкер-2 (Рис. 6).

Рис. 6. Относительное содержание ДГК в исследованных препаратах с более высоким качеством стандартизации. Препараты упорядочены по убыванию относительного содержания ДГК.

Заключение

Препараты омега-3 ПНЖК отпускаются без рецепта. Информацию о необходимости коррекции потребления омега-3 ПНЖК пациенты получают через СМИ, в интернет-пространстве, и, значительно реже, от врачей, рекомендующих тот или иной препарат. Поэтому, окончательный выбор препарата омега-3 ПНЖК осуществляет пациент, зачастую, по совету фармацевта в аптеке.

В действительности, эффективность препаратов ω3 ПНЖК в существенной мере зависит от стандартизации содержания экстрактов по ЭПК, ДГК и по другим видам жирных кислот. В настоящей работе мы провели комплексное исследование состава 11 препаратов ω3 ПНЖК с хроматографическим определением более 40 метаболитов жирных кислот и других соединений. Получены количественные маркёры, позволяющие отделять препараты на основе стандартизированных ω3 ПНЖК (Омакор, Солгар омега-3 700, Солгар омега-3 950, Фемибион наталкер-2, Омега-3 концентрат и Омегамама) от менее стандартизированных препаратов (Fish oil-Teva, Омегатрин, Омеганол). В стандартизированных препаратах значения маркёра «ЭПК+ДГК» в 2.5 выше (Р=0.0016), а маркёра «ω6+ω11» — в 5 раз ниже (Р=0.0004). Вычисления коэффициента стандартизации, оценивающего соответствие измеренных уровней омега-3 ПНЖК заявленному производителем содержанию, показали, что препараты Омакор, Солгар омега-3 950, Фемибион наталкер-2 и Омегамама характеризовались наилучшей стандартизацией.

Препараты на основе высокоочищенных стандартизированных форм омега-3 ПНЖК представляют собой важный резерв профилактики патологий беременности (тромбофилии, депрессии, преждевременных родов и др.) и плода (патологии зрения, замедление нервнопсихического развития и др.). Принимая во внимание достаточно высокое качество стандартизации (КСТ=108.2%, «ЭПК+ДГК»=24%, «ω6+ω11»=5%) и самое высокое относительное содержание ДГК, препарат ОмегаМама, по всей видимости, наиболее приемлем для беременных. Следует подчеркнуть, что используемая для производства данного препарата субстанция MEG-3@ (пр-во DSM, Швейцария) имеет европейский статус фармацевтической субстанции и сертификат фармакологического качества Ph/Eur для применения у беременных, кормящих и у детей, начиная с периода новорожденности.

Литература

  1. Лиманова О.А. , Громова О.А., Торшин И.Ю., Волков А.Ю., Галустян А.Н., Гришина Т.Р., Керимкулова Н.В., Сардарян И.С., Сонина Н.П., Томилова И.К., Федотова Л.Э. Низкое потребление омега-3 полиненасыщенных жирных кислот и риск различных заболеваний у женщин репродуктивного возраста. РМЖ, №9, 2017, с.33-45.
  2. Громова О.А., Торшин И.Ю., Захарова И.Н., Томилова И.К., Галустян А.Н. Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты: природные источники и значение в педиатрической практике. РМЖ. 2017. Т. 25. № 11. С. 836-842.
  3. Мареев В. Ю. Отчет о работе Совета экспертов «Актуальность применения этиловых эфиров омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ω-3 ПНЖК, 90 %, 1 г) у постинфарктных пациентов с сопутствующей кардиологической патологией». Сердце: журнал для практикующих врачей. 2016;15 (4):301–304. DOI: 10.18087 / rhj.2016.4.2260
  4. Громова О.А., Торшин И.Ю., Калачева А.Г., Грустливая У.Е., Керимкулова Н.В., Гришина Т.Р., Гусев Е.И. Перспективы использования стандартизированных форм омега-3 полиненасыщенных жирных кислот в неврологии. Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова. 2012. Т. 112. № 1. С. 101-105.
  5. Торшин И.Ю., Гусев Е.И., Громова О.А., Калачева А.Г., Рудаков К.В. Мировой опыт изучения эффектов омега-3 полиненасыщенных жирных кислот: влияние на когнитивный потенциал и некоторые психические расстройства. Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова. 2011. Т. 111. № 11. С. 79-86.
  6. Mason RP, Sherratt SCR. Omega-3 fatty acid fish oil dietary supplements contain saturated fats and oxidized lipids that may interfere with their intended biological benefits. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Jan 29;483(1):425-429. doi: 10.1016/j.bbrc.2016.12.127. Epub 2016 Dec 21. PubMed PMID: 28011269.
  7. Kutzner L, Ostermann AI, Konrad T, Riegel D, Hellhake S, Schuchardt JP, Schebb NH. Lipid Class Specific Quantitative Analysis of n-3 Polyunsaturated Fatty Acids in Food Supplements. J Agric Food Chem. 2017 Jan 11;65(1):139-147. doi: 10.1021/acs.jafc.6b03745. Epub 2016 Dec 22. PubMed PMID: 28005361.
  8. Васьковский В.Е., Горбач Т.А., Есипов А.В., Светашев В.И., Яцкова М.А. Препараты омега-3 жирных кислот и их применение в медицине. Тихоокеанский медицинский журнал, 2010, № 2 (40), с. 15-20.
  9. I. Yu. Torshin and K. V. Rudakov, “On the theoretical basis of the metric analysis of poorly formalized problems of recognition and classification,” Pattern Recogn. Image Anal. 25 (4), 577–587 (2015).
  10. Torshin I.Y., Rudakov K.V. Combinatorial analysis of the solvability properties of the problems of recognition and completeness of algorithmic models. part 1: factorization approach. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2017. Т. 27. № 1. С. 16-28.
  11. Torshin I.Yu., Rudakov K.V. Combinatorial analysis of the solvability properties of the problems of recognition and completeness of algorithmic models. part 2: metric approach within the framework of the theory of classification of feature values. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2017. Т. 27. № 2. С. 184-199.
  12. Torshin I.Y., Rudakov K.V. On metric spaces arising during formalization of problems of recognition and classification. part 1: properties of compactness. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2016. С. 1.
  13. Torshin I.Yu., Rudakov K.V. On metric spaces arising during formalization of problems of recognition and classification. part 2: density properties. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2016. Т. 26. № 3. С. 483-496.
  14. Torshin I.Y. Optimal dictionaries of the final information on the basis of the solvability criterion and their applications in bioinformatics. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2013. Т. 23. № 2. С. 319-327.
  15. ГромоваО.А., КалачеваА.Г., ТоршинИ.Ю., РудаковК.В., ГрустливаяУ.Е., ЮдинаН.В., ЕгороваЕ.Ю., ЛимановаО.А., ФедотоваЛ.Э., ГрачеваО.Н., НикифороваН.В., СатаринаТ.Е., ГоголеваИ.В., ГришинаТ.Р., КурамшинаД.Б., НовиковаЛ.Б., ЛисицынаЕ.Ю., КеримкуловаН.В., ВладимироваИ.С., ЧекмареваМ.Н. ссоавт. Недостаточность магния — достоверный фактор риска коморбидных состояний: результаты крупномасштабного скрининга магниевого статуса в регионах России. Фарматека. 2013. № 6 (259). С. 115-129.
  16. Ghebremeskel K, Min Y, Crawford MA, Nam JH, Kim A, Koo JN, Suzuki H. Blood fatty acid composition of pregnant and nonpregnant Korean women: red cells may act as a reservoir of arachidonic acid and docosahexaenoic acid for utilization by the developing fetus. Lipids. 2000 May;35(5):567-74. PMID: 10907792.

Сведения об авторах:

Громова Ольга Алексеевна – д-р мед. наук, проф., в.н.с., научный руководитель Института Фармакоинформатики, ФИЦ «Информатика и Управление» РАН, Адрес: 119333, Москва, ул. Вавилова, 42, Телефон: +7(916) 108-09-03 e-mail: unesco.gromova@gmail.com, сайт: pharmacoinformatics.ru РИНЦ SPIN-код: 6317-9833, AuthorID: 94901, ScopusAuthorID: 7003589812, ORCIDiDhttps://orcid.org/0000-0002-7663-710X, WOSIDJ-4946-2017

Торшин Иван Юрьевич, к.х.н., с.н.с. Институт Фармакоинформатики, ФИЦ «Информатика и Управление» РАН, Адрес: 119333, Москва, ул. Вавилова, 42, Телефон: (499) 135-2489 ScopusAuthorID: 7003300274, РИНЦSPINкод: 1375-1114,  AuthorID: 54104,  ORCIDiD 0000-0002-2659-7998,  WOSID C-7683-2018

Борис Лейбович Зайчик, к.т.н., старший научный сотрудник группы «Аналитическая биохимия» ФИЦ Биотехнологии РАН (Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН) Тел.: +7 (495) 926-67-10, 119071, Россия, Москва, Ленинский проспект, дом 33, стр 2.www.ilab-inbi.ru

Тетруашвили Нана Картлосовна, д.м.н., профессор, зав. 2-м отделением акушерским патологии беременности ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: n_tetruashvili@oparina4.ru

Рудаков Константин Владимирович, акад. РАН, д.ф-м.н., проф., зам. директора Федерального Исследовательского Центра Информатика и Управление РАН, директор Института Фармакоинформатики, зав. кафедрой интеллектуальные системы МФТИ, Адрес: 119333, г. Москва, ул. Вавилова, д. 42.